一、目的要求

1、掌握各種分離、接種方法。

2、掌握無菌操作基本環節。

二、實驗說明

微生物在自然界中呈混雜狀態存在，要獲得所需菌種，必需從中把它們分離出來。在保存菌種時不慎受到到污染也需予以分純。微生物分離和純化的方法很多，但基本原理卻是相似的，即將待分離的樣品進行一定的稀釋，并使微生物的細胞（或孢子）盡量以分散狀態存在，然后使其長成一個個純種單菌落。然而上述工作又離不開接種，即將一種微生物移到另一滅過菌的培養基上的過程。

三、實驗材料

1、恒溫培養箱。

2、接種環、玻璃棒、吸管、酒精燈。

3、培養基（上次實驗配制的）。

4、大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌。

四、方法步驟

（一）接種的操作

1、斜面接種（接金黃葡萄球菌）

（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精揮發后點燃酒精燈。

（2）將菌種管和斜面握在左手大姆指和其它四指之間，使斜面和有菌種的一面向上，并處于水平位置。

（3）先將菌種和斜面的棉塞旋轉一下，以便接種時便于拔出。

（4）左手拿接種環（如握鋼筆一樣），以火焰上先將環端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管其余部位也過火滅菌。

（5）用右手的無名指、小指和手掌將菌種管和待接斜面試管的棉花塞或試管帽同時拔出，然后讓試管口緩緩過火滅菌（切勿燒過燙）。

（6）將灼燒過的接種環伸入菌種管內，接種環在試管內壁或未長菌苔的培養基上接觸一下，讓其充分冷卻，然后輕輕刮取少許菌苔，再從菌種管內抽出接種環。

（7）迅速將沾有菌種的接種環伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來回密集劃線。有時也可用接種針僅在培養基的中央拉一條線來作斜面接種，以便觀察菌種的生長特點。。

（7）迅速將沾有菌種的接種環伸入另一支待接斜面試管。從斜面底部向上作“Z”形來回密集劃線。有時也可用接種針僅在培養基的中央拉一條線來作斜面接種，以便觀察菌種的生長特點。

（8）接種完畢后抽出接種環灼燒管口，塞上棉塞。

（9）將接種環燒紅滅菌。放下接種環，再將棉花塞旋緊。

2、液體接種

（1）由斜面培養基接入液體培養基，此法用于觀察細菌的生長特性和生化反應的測定，操作方法與前相同，但使試管口向上斜，以免培養液流出接入菌體后，使接種環和管內壁磨擦幾下以利洗下環上菌體。接種后塞好棉塞將試管在手掌中輕輕敲打，使菌體充分分散。

（2）由液體培養基接種液體培養基，菌種是液體時，接處除用接種環外尚用無菌吸管或滴管。接種時只需在火焰旁拔出棉塞,將管口通過火焰,用無菌吸管吸取菌液注入培養液內,搖勻即可。

3、平板接種

將菌在平板上劃線和涂布。

（1）劃線接種 見分離劃線法。

（2）涂布接種 用無菌吸管吸取菌液注入平板后，用滅菌的玻棒在平板表面作均勻涂布。

4、穿刺接種

把菌種接種到固體深層培養基中，此法用于嫌氣性細菌接種或為鑒定細菌時觀察生理性能用。

（1）操作方法與上述相同，但所用的接種針應挺直。

（2）將接種針自培養基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途徑慢慢拔出。

（二）分離的操作方法

1、稀釋分離法

通過不斷稀釋使被分離的樣品分散到zui低限度，然后吸取一定量注入平板與溫度適合溶化了的瓊脂培養基混合，這樣分散的細菌被固定在原處而形成單菌落。

（1）將大腸桿菌或酵母菌用無菌水制作菌懸液。

（2）取若干支無菌試管，每支內盛9ml無菌水。

（3）吸取1ml制備好的菌懸液，置于*支含有9ml無菌水的試管內，這樣就稀釋了10倍，也就是10^-2。

（4）從*支試管內（10^-2）吸取1ml注入第二支含有無菌水的試管內，這樣就稀釋了100倍，也就是10^-2。

（5）用同樣方法操作，直至稀釋至10^-5-10^-6。

（6）分別吸取10^-5-10^-6各稀釋度菌液0.2ml加入編好號的空無菌平皿中，同一稀釋度重復做三個平皿。

（7）將已溶化并冷卻至45℃的瓊脂培養基倒入上述各平皿內，輕輕旋轉使培養基與菌懸液充分混勻，凝固后倒置于37℃或38℃度恒溫箱中培養24-48小時，觀察平板上菌落生長和分布情況。

2、平板劃線分離法

平板劃線分離法是接種環在平板培養基表面通過分區劃線而達到分離微生物的一種方法。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的。

（1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平板，水平靜置待凝。

（2）在酒精燈光焰上灼燒接種環，待冷，取一接種環金黃葡萄球菌、大腸桿菌混合菌液。

（3）左手握瓊脂平板稍抬起皿蓋，同時靠近火焰周圍，右手持接種環伸入皿內，在平板上一個區域作之形回劃線，劃線時例接種環與平板表面成30-40°角度輕輕接觸，以腕力在表面作輕快的滑動，勿使平板表面劃破或嵌進增基內。

（4）灼燒接種杯，以殺滅接種環上尚殘余的菌液，待冷卻后，再將接種環伸入皿內，在*區域劃過線的地方稍接觸一下后，轉動90°，在第二區域繼續劃線。

（5）劃畢后再灼燒接種杯，冷卻后用同樣方法在其他區域劃線。

（6）全部劃線完畢后，在平皿底用特種蠟筆注明菌種、日期、組別、姓名。將整個培養皿倒置放入恒溫箱培養。

（7）37℃經過24-48小時培養后取出觀察。注意菌落的開關、大小、顏色、邊緣、表面結構、透明度等性狀。

附一 無菌操作環節

（1）接種室應保持清潔，用煤粉酚皂液擦洗臺面及墻壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均應用紫外燈滅菌。定期對接種室作無菌程度的檢查。

（2）進入接種室前，應先做好個人衛生工作，在緩沖間內要更換工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只準在接種室內使用。不準穿到其它地方去，并要定期更換、消毒。

（3）接種的試管、三角并瓶等應做好標記，注明培養基、菌種的名稱、日期。移入接種室內的所有物品，均須在緩沖室用70%酒精擦試干凈。

（4）接種前，雙手用70%酒精或新潔爾消毒，操作過程不離開酒精燈火焰；棉塞不亂放；接種工具使用前后均需火焰滅菌。

（5）培養箱應經常清潔消毒。

附二 接種室的消毒方法

1、紫外線滅菌

接種室使用前打開紫外燈照射約30分鐘，就能使空氣和室壁表面基本上無菌。為了加強滅菌效果，在開燈以前可以在接種內噴灑石炭酸溶液，使空氣中附有微生物的塵埃降落，并殺死一些微生物。接種室的臺面等，可以用2-3%的來蘇爾擦洗。

紫外線對人體皮膚，尤其對眼睛具有殺傷力，因皮不要直視開著的紫外燈，也不能在開著燈的情況下工作。

2、噴灑石炭酸

將石炭酸水浴，稍熱，使之溶解。用吸耳球通過吸管吸取該溶液，配成5%溶液。對于小房間，可用噴霧器由上至下、由里至外順序進行噴霧，并門，稍等片刻即可使用。石炭酸對皮膚有較強的毒害作用，使用時不要接觸皮膚。

3、福爾馬林熏蒸

（1）用量：市售福爾馬林是37-40%的甲醛水溶液。常用量按每立方空間2-6ml計算。

（2）熏蒸方法：用福爾馬林熏蒸有兩種方法：

①加熱熏蒸：按熏蒸空間計算,量取甲醛溶液,放在酒精燈上方的小鐵筒或燒杯中,點燃酒精燈,關閉室門。酒精燈在甲醛蒸完后即自行熄滅。

②氧化熏蒸：在一瓷杯里鋪一張報紙，放入高猛酸鉀（其用量為1/2甲醛量），再取定量的甲醛溶液，倒在盛有高猛酸鉀的容器里，立即關門。幾秒鐘后，由高猛酸鉀氧化甲醛反應所產生的熱將其余的甲醛蒸為氣體。

由于甲醛對人眼、鼻有強烈的刺激作用，熏蒸后相當時間內不能進入室內工作。因此，接種室至少在使用前24小時進行熏蒸，房間應密閉，保持12小時。之后可取與甲醛等更是的氨水，倒在一個瓷碗里，放入熏蒸過的接種室，以減少甲醛對人的刺激作用。用氨水中和，至少應在工作前2小時進行。

4、過濾除菌

近幾年來，多采用一種稱之為超凈工作臺的接種室，其原理是借助于一鼓風機將普通空氣鼓入，通過粗濾、超濾纖維過濾后，進入工作臺內的空氣即為無菌空氣。整個工作室內要求清潔無塵，這樣可延長超凈工作臺的使用壽命。

新的超凈工作臺使用前，要進行無菌試驗，確定合格方可使用，接種前，應先將工作臺開啟5-6分鐘。

附三 接種室無菌程度檢查

取無菌的營養瓊脂平板，在接種室內臺上和臺下各放一套，把皿蓋打開15min，然后蓋好，倒置37℃恒溫培養24-28小時，如果每個皿內菌落不超過4個，則可以認為無菌程度良好，若菌落很多，則應對接種室進一步滅菌。